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分子克隆 / 亚克隆
载体构建 · 定点突变

提供PCR扩增、酶切连接/无缝克隆、亚克隆、定点突变、载体改造等分子克隆基础服务,为下游表达、病毒包装、功能研究提供可靠载体,测序验证后交付。

目的基因怎么正确装进载体

核心原理
注意事项
小知识点

限制性内切酶+连接酶:靠“互补粘性末端”拼接

限制性内切酶能识别DNA上特定的回文序列,并在固定位置切割双链,很多酶切割后会在两侧留下彼此互补的单链突出(粘性末端)。只要载体和目的片段用同一种酶切割,两者的粘性末端序列就能互补配对、退火结合,DNA连接酶再催化相邻核苷酸之间形成磷酸二酯键,把切口封起来,完成两段DNA的共价连接。

无缝克隆(Gibson组装):三种酶协同完成的等温反应

Gibson组装不依赖酶切位点,而是要求待连接片段末端本身带有一段人为设计的同源重叠序列。反应体系中的核酸外切酶从DNA末端5'端开始逐步降解,暴露出3'单链突出;这些单链突出如果彼此同源,就会自动退火配对;随后DNA聚合酶补齐缺口处的空缺碱基,连接酶最后封上剩余的缺刻——三种酶在同一个反应体系里协同完成,一步等温反应即可完成多片段的定向组装,不再受限于载体上现成的酶切位点。

克隆的基本流程

通过PCR从模板中扩增出目的片段,经过限制性内切酶酶切(或采用无缝克隆等非酶切依赖的方法)后与线性化载体连接,转化进感受态细胞并筛选出阳性克隆,最后通过测序确认插入片段序列完全正确后交付。

定点突变对引物设计要求较高

定点突变通常需要在引物中引入目标突变位点,同时保证突变位点两侧有足够长度的同源退火区域,引物设计质量直接决定突变效率和正确率,建议使用专业设计工具并预留验证测序的时间和预算。

为什么克隆完成后一定要测序验证?

无论采用哪种连接方式,都存在插入片段方向错误、发生非预期突变、载体自连(未插入目的片段)等可能性,只有通过测序才能100%确认最终拿到的克隆序列完全符合预期,这是分子克隆环节中不可省略的质控步骤。

无缝克隆一定比酶切连接更好吗?

不一定,取决于具体需求。无缝克隆灵活性更高、更适合复杂多片段组装,但成本通常更高;如果载体上刚好有合适的酶切位点、且只是简单的单片段插入,传统酶切连接可能更经济高效,两种方法各有适用场景。

实验目的与应用场景

实验目的

几乎所有分子生物学实验的起点——当你需要把目的基因、突变位点或调控元件组装进合适的载体骨架时,分子克隆是绕不开的基础工具。

应用场景

技术原理与应用方向

技术原理

通过PCR获得目的片段,经限制性内切酶或同源重组(Gibson/In-Fusion)连接至载体,转化后经菌落PCR与测序验证;定点突变通过引物引入碱基改变实现。

应用方向

表达载体构建、报告载体构建、病毒载体构建、突变体制备等,是基因合成、病毒包装、CRISPR文库筛选等下游服务的基础环节。

服务优势

测序验证保障

菌落PCR+测序双重验证,确保序列正确

周期短见效快

常规1-2周交付,基础款载体构建效率高

多种连接策略

酶切连接/Gibson/In-Fusion同源重组任选

下游服务无缝衔接

载体可直接对接病毒包装、稳转株构建等后续服务

交付说明

常规载体构建约1-2周
定点突变/复杂载体改造约2-3周(视复杂度沟通确认)
交付内容:测序验证正确的质粒(提取纯化后)与完整序列文件;特殊载体设计建议提前与技术顾问沟通可行性。

订购流程

1

需求沟通

提交实验方案与目标

2

方案确认

技术顾问确认工艺与周期

3

预付下单

支付不低于50%项目启动款,正式排产

4

生产质控

全流程质控留档

5

交付验收

结清尾款,完成验收

付款与验收说明

项目启动款说明

标准订单及定制/大额订单均需支付不低于合同总额的50%作为项目启动款,剩余尾款支付时限根据具体项目另行约定。

验收说明

客户收到产品或报告后,请于1个月内完成验收;如对交付结果有异议,请于此窗口期内提出,我们将在2个工作日内响应并协助处理。

免责声明:本页面所示交付周期、技术参数为常规参考区间,具体以订单确认单为准。 ↑ 返回页面顶部
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