把标记好的DNA/RNA探针与候选结合蛋白在体外孵育后进行非变性凝胶电泳,游离的探针分子量小、迁移速度快;如果蛋白确实结合到了探针上,形成的蛋白-核酸复合物分子量更大,在凝胶中的迁移速度会明显变慢,呈现出条带位置“上移”(即出现Shift)的现象,通过对比有无目标蛋白孵育的条带位置差异,判断是否存在结合。
竞争实验通过加入过量未标记的相同序列探针,如果条带迁移变化被削弱/消失,说明结合具有序列特异性;超迁移(Supershift)实验加入针对目标蛋白的特异性抗体,如果抗体也结合上了复合物,条带会进一步迁移得更慢,用于确认复合物中确实含有目标蛋白(而非其他非特异性结合蛋白)。
探针序列需要准确覆盖预测的蛋白结合位点(如转录因子结合基序),过短或偏离核心区域都可能导致检测不到真实存在的结合关系,建议结合已知的结合基序数据库或前期生信预测结果设计探针范围。
EMSA是体外生化验证,能直接看到结合与否及大致的结合强度差异,操作相对快速;酵母单杂交是在酵母细胞体系内的间接验证,更适合大规模筛选未知的DNA结合蛋白。两者常常配合使用,酵母单杂交筛出候选蛋白后,用EMSA做进一步的生化验证。
SDS-PAGE会使蛋白变性并带上均一负电荷,破坏蛋白与核酸之间原本的天然结合状态;EMSA需要保留蛋白-核酸复合物的天然结合构象,因此必须使用非变性条件的电泳体系。
当你想验证“这个转录因子是否真的能结合到这段DNA序列上”时,EMSA能在体外直接、直观地证明这种结合关系——回答“蛋白和DNA之间,到底有没有直接结合”。
核酸探针(同位素或生物素/荧光标记)与蛋白孵育后,结合了蛋白的核酸-蛋白复合物因分子量增大、电荷改变,在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移速率减慢,形成滞后条带(shift);加入过量未标记竞争探针可使条带减弱,加入特异抗体可产生进一步滞后(supershift),从而确认结合的特异性。
转录因子-DNA结合验证、RNA结合蛋白研究、结合位点鉴定等。
竞争实验+Supershift双重验证
含探针制备、孵育、电泳全流程
含实验报告与结果解读
同位素/生物素/荧光标记可选
提交实验方案与目标
技术顾问确认工艺与周期
支付不低于50%项目启动款,正式排产
全流程质控留档
结清尾款,完成验收
标准订单及定制/大额订单均需支付不低于合同总额的50%作为项目启动款,剩余尾款支付时限根据具体项目另行约定。
客户收到产品或报告后,请于1个月内完成验收;如对交付结果有异议,请于此窗口期内提出,我们将在2个工作日内响应并协助处理。