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Co-IP
免疫共沉淀

在近生理条件下验证内源或外源蛋白间的相互作用,可检测内源性蛋白复合物,较好地保留生理状态下的互作关系。

怎么“钓”出蛋白复合物

总览
选择指南
核心原理
注意事项
小知识点

验证"两个蛋白是否真的抱在一起"

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)是验证两个蛋白之间是否存在物理相互作用最经典的方法之一。核心逻辑是:用特异性抗体"钓出"目标蛋白(诱饵蛋白),如果有另一个蛋白(猎物蛋白)真的与它结合在一起,就会被一并"捞出来",通过后续Western blot检测猎物蛋白是否出现,从而确认两者存在结合关系。

Co-IP在什么阶段介入比较合适

通常在酵母双杂交、生物信息学预测(如结构对接分析)等方法已经给出"这两个蛋白可能相互作用"的初步线索之后,Co-IP用于在更接近细胞真实生理环境下进一步验证这一假设——相比酵母双杂交在酵母细胞核内的人工检测系统,Co-IP直接在哺乳动物细胞裂解液中操作,结果更贴近真实生理状态。

内源Co-IP还是过表达Co-IP

内源Co-IP

直接检测细胞内天然表达水平的蛋白互作,结果最接近真实生理状态,但对目的蛋白的天然丰度和抗体质量要求更高,如果蛋白本身表达量低,信号可能很弱。

过表达Co-IP

通过质粒转染让细胞过表达带标签的诱饵/猎物蛋白(如Flag/HA标签),可以用成熟的标签抗体检测,信号更强更稳定,但过表达本身可能带来非生理性的假阳性互作。

提示:如果条件允许,建议内源Co-IP和过表达Co-IP相互印证,单独依赖某一种方式的结果,说服力相对有限。

磁珠/琼脂糖珠是怎么"钓"出目标蛋白的

蛋白A/G磁珠(或琼脂糖珠)表面偶联了能特异性结合抗体Fc段的蛋白A/G分子。实验时先让诱饵蛋白的特异性抗体与细胞裂解液中的诱饵蛋白结合,再加入磁珠,抗体的Fc段被磁珠上的蛋白A/G捕获——这样,"诱饵蛋白+抗体+磁珠"整个复合物就能通过磁力或离心从裂解液中分离出来,如果诱饵蛋白当时正与猎物蛋白结合,猎物蛋白也会被一并带出。

蛋白A/G为什么偏偏能结合抗体

蛋白A、蛋白G分别来自金黄色葡萄球菌和链球菌,是这些细菌进化出的表面蛋白,天然功能是结合宿主IgG抗体的Fc恒定区,从而干扰宿主的免疫识别、帮助细菌逃避免疫清除。这种对抗体Fc段的高特异性结合能力,被科学家借用改造成了免疫沉淀实验的核心工具——固定在磁珠表面后,就能稳定地把任意一种IgG抗体、以及抗体结合的目标蛋白,一起从复杂的裂解液中捕获出来。

裂解条件的选择很关键

裂解液的强度(去污剂种类和浓度)直接影响能否既充分裂解细胞、又不破坏蛋白间原本的相互作用——裂解条件过于剧烈,可能把本来存在的弱相互作用冲散;裂解不充分,又可能无法有效释放胞内蛋白。需要根据目标蛋白的亚细胞定位和互作强度特点,选择合适的裂解体系。

对照组是判断结果可信度的关键

必须设置IgG同型对照(用无关的同种属抗体代替特异性抗体做平行实验),用于排除"蛋白非特异性吸附在磁珠或抗体上"这种假阳性可能——如果IgG对照组也能检测到猎物蛋白信号,说明结果不可信,需要优化实验条件。

Input对照不能省略

除了IP实验组和IgG对照组,还需要保留一部分未经免疫沉淀处理的原始裂解液作为Input对照,用于确认裂解液中确实存在诱饵和猎物蛋白,也便于评估共沉淀的富集效率。

瞬时互作可能检测不到

Co-IP更容易检测到相对稳定的蛋白复合物,如果两个蛋白的相互作用本身是瞬时的、弱亲和力的(比如某些信号转导中的一过性结合),常规Co-IP条件下可能难以捕获,这种情况需要考虑交联剂等特殊处理手段。

Co-IP能证明两个蛋白直接结合吗?

不能完全确定。Co-IP检测到的是“沉淀下来的蛋白复合物”,猎物蛋白可能通过第三方蛋白间接与诱饵蛋白连接在一起,而不一定是直接物理接触。如果需要证明“直接结合”,通常还需要GST pull-down等体外重组蛋白实验或结构生物学证据进一步佐证。

为什么Co-IP实验经常需要反向验证(两个方向都做一次)?

正向Co-IP用蛋白A的抗体去钓,反向Co-IP用蛋白B的抗体去钓,如果两个方向都能检测到对方,结果的可信度会大幅提高,这也是审稿人经常要求的“双向验证”标准做法,能有效降低单方向实验偶然性带来的假阳性风险。

Co-IP和GST pull-down有什么区别?

Co-IP是在细胞裂解液(含有细胞内所有蛋白及可能的第三方连接蛋白)背景下验证互作,更接近生理环境但不能区分直接/间接结合;GST pull-down通常使用体外纯化表达的重组蛋白,背景更“干净”,更适合验证两个蛋白是否“直接”结合,两者互为补充。

实验目的与应用场景

实验目的

当你已经通过酵母双杂交或生物信息学预测,怀疑两个蛋白之间存在相互作用,但需要在更接近细胞真实环境下确认时,Co-IP是最常用的验证手段——回答“这两个蛋白在细胞里,真的会结合在一起吗”。

应用场景

技术原理与应用方向

技术原理

利用针对目标蛋白(诱饵)的特异性抗体与蛋白A/G磁珠或琼脂糖偶联,从细胞裂解液中富集目标蛋白及其结合的相互作用蛋白(猎物),再经Western blot或质谱鉴定共沉淀下来的互作蛋白,从而确认蛋白间的结合关系。

应用方向

蛋白复合物鉴定、互作确认、翻译后修饰研究等。

服务优势

近生理条件验证

较好保留细胞内真实互作关系

周期约3-4周

含裂解、免疫沉淀、WB鉴定全流程

WB检测图交付

含实验报告与结果解读

可配合质谱鉴定

深入分析互作蛋白复合物成分

交付说明

Co-IP检测约3-4周
交付内容:WB检测图与实验报告;如需质谱鉴定互作蛋白,请提前与技术顾问沟通方案。

订购流程

1

需求沟通

提交实验方案与目标

2

方案确认

技术顾问确认工艺与周期

3

预付下单

支付不低于50%项目启动款,正式排产

4

生产质控

全流程质控留档

5

交付验收

结清尾款,完成验收

付款与验收说明

项目启动款说明

标准订单及定制/大额订单均需支付不低于合同总额的50%作为项目启动款,剩余尾款支付时限根据具体项目另行约定。

验收说明

客户收到产品或报告后,请于1个月内完成验收;如对交付结果有异议,请于此窗口期内提出,我们将在2个工作日内响应并协助处理。

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