提供基因过表达(Overexpression)与RNAi干扰(shRNA/miRNA敲低)稳定细胞系构建服务,涵盖致死曲线测定、载体构建、转染/慢病毒侵染、抗性筛选、单克隆挑选与表达验证全流程。
常规的质粒瞬时转染,外源DNA大多以游离状态存在于细胞核内,不会整合进宿主染色体,随着细胞分裂会被逐渐稀释、丢失,通常几天到一两周后表达量就明显下降。稳定细胞株要解决的正是这个问题——通过慢病毒侵染(基因组随机整合效率高)或质粒转染后偶发的随机整合事件,让外源基因序列真正插入到宿主染色体DNA中,此后每次细胞分裂,这段外源序列都会作为基因组的一部分被复制、遗传给子代细胞,从而实现长期、稳定的表达或干扰效果。
转染/侵染后的细胞群体中,只有一小部分细胞真正发生了基因组整合,其余大多数是没有整合成功的“阴性”细胞。载体上通常带有抗性基因(如嘌呤霉素抗性、G418抗性),只有整合成功、持续表达抗性基因的细胞才能在相应抗生素的选择压力下存活,其余细胞会被抗生素杀死——这个“物竞天择”的过程,就是抗性筛选能够把极少数阳性克隆从庞大的阴性细胞群体中富集出来的核心逻辑。
正式筛选前,需要先用一系列浓度梯度的抗生素处理未转染的野生型细胞,测定能在合理时间内(通常1-2周)杀死全部细胞的最低抗生素浓度(致死曲线),以此确定后续筛选阶段的实际用药浓度——浓度过低筛选不彻底,过高可能连阳性克隆也一并误杀。
过表达稳转株构建后,通常还需要通过Western blot或qPCR验证目的基因是否真的实现了预期的过表达水平;shRNA干扰稳转株除了验证载体是否整合,还需要确认敲低效率是否达到实验要求的阈值,敲低效率不理想的克隆需要被排除,不能简单以“抗性筛选存活”作为唯一的成功标准。
抗性筛选存活下来的细胞群体中,不同细胞携带的载体拷贝数、整合位点可能各不相同,导致表达水平参差不齐;单克隆挑选能确保后续实验使用的是遗传背景均一、表达水平稳定一致的细胞群体,大幅提高实验结果的可重复性。
慢病毒侵染的基因组整合效率通常更高、更适合难转染的细胞类型(如原代细胞、悬浮细胞);质粒转染直接操作、成本更低,但整合效率相对较低,对于容易转染的贴壁细胞系,质粒转染配合抗性筛选也是常见的经济方案,具体选择需要结合目标细胞类型和预算综合考虑。
当你需要长期、稳定地观察某个基因改变对细胞的持续影响,而不只是短暂的瞬时表达窗口时,稳定细胞株能提供可重复、可长期使用的实验体系——回答“怎么让这个改变,在细胞里‘永久’保留下来”。
将携带抗性基因的目的载体(质粒或慢病毒)导入细胞,先用致死曲线确定最佳筛选浓度,再利用抗生素(如puromycin、G418)持续筛选出稳定整合并表达的细胞群体,经单克隆化与qPCR/WB验证获得稳转细胞株。
基因功能长期研究、药物筛选模型、报告基因细胞系、体内成瘤实验种子细胞等。
致死曲线-载体构建-侵染-筛选-单克隆-验证一站式
交付T25稳转细胞株并附验证报告
单克隆化后经qPCR/WB确认表达水平
相比瞬时转染,多代传代维持稳定表型
提交实验方案与目标
技术顾问确认工艺与周期
支付不低于50%项目启动款,正式排产
全流程质控留档
结清尾款,完成验收
标准订单及定制/大额订单均需支付不低于合同总额的50%作为项目启动款,剩余尾款支付时限根据具体项目另行约定。
客户收到产品或报告后,请于1个月内完成验收;如对交付结果有异议,请于此窗口期内提出,我们将在2个工作日内响应并协助处理。