质粒（Plasmid）是一种独立于细菌染色体之外、能够自主复制的环状双链DNA分子，天然存在于细菌、部分古菌和真核生物细胞中，是分子生物学中最基础也最常用的基因载体工具。
天然质粒最早在细菌中被发现，携带抗生素抗性等有利于宿主生存的基因。20世纪70年代，科学家们通过基因工程技术对天然质粒进行改造——去除非必需序列、引入多克隆位点、组装启动子和筛选标记，逐步发展出今天实验室里使用的各类"人工质粒载体"。可以说，每一个实验用质粒，都是"天然质粒骨架 + 人工设计元件"的组合产物。
与病毒载体（慢病毒/腺病毒/AAV）相比，质粒不需要包装、制备周期短、成本低，但递送效率通常低于病毒载体，且在多数细胞中以瞬时表达为主（不整合基因组）。这也是为什么"先用质粒瞬转做初筛，验证有效后再用病毒载体做稳定表达/体内实验"是一条很常见的实验路径（可参考基因递送工具全维度对比）。
| 骨架家族 | 特点 | 常见用途 |
|---|---|---|
| pUC系列 | 高拷贝（约500-700拷贝/细胞），骨架小 | 常规克隆、DNA片段保存与扩增 |
| pBR322系列 | 中低拷贝，历史最悠久的质粒骨架之一 | 经典克隆载体，部分改造衍生表达载体 |
| pET系列 | 含T7启动子，IPTG诱导表达 | 大肠杆菌原核蛋白表达 |
| pcDNA系列 | 含CMV启动子，哺乳动物表达元件齐全 | 哺乳动物细胞瞬时/稳定表达 |
| pGEX系列 | 含GST标签、tac启动子 | 原核系统GST融合蛋白表达纯化 |
| pGL系列 | 含荧光素酶报告基因骨架 | 启动子活性分析、双荧光素酶实验 |
| pLV / pLKO系列 | 慢病毒转移质粒骨架 | 慢病毒包装、稳定细胞系构建、shRNA干扰 |
以上均为分子生物学领域公开、通用的经典骨架家族名称，非任何单一供应商专有。
哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母、大肠杆菌，各自需要匹配对应的启动子体系——比如CMV启动子在哺乳动物细胞里高效，但放到大肠杆菌里完全不起作用。
如果实验需要同时转染/共表达多个质粒，或者细胞系本身已经带有某种抗性，一定要提前核对每个质粒的抗性标记（Amp/Kan/Hyg/Neo等）是否会互相冲突。
决定质粒能否在特定宿主中自主复制，以及复制的拷贝数。常见的大肠杆菌复制起点有pUC（高拷贝，约500-700拷贝/细胞）、pBR322/ColE1（中拷贝）、p15A（低拷贝，常用于双质粒共存实验）。
用于在培养基中筛选出成功摄入质粒的细胞/菌株。常见的有氨苄西林抗性（Amp/AmpR）、卡那霉素抗性（Kan/KanR）、氯霉素抗性（Cm/CmR，常用于低拷贝质粒）、潮霉素抗性（Hyg，哺乳动物细胞筛选常用）、G418抗性（Neo，哺乳动物细胞筛选常用）。
决定目的基因"在哪里、以多强的强度"被转录。哺乳动物细胞常用CMV（强、广谱）、EF1α（强度适中但更稳定持久）、CAG（强，常用于体内表达）；原核表达常用T7（配合T7 RNA聚合酶的高效诱导表达）、lac/araBAD（可诱导型）。
多克隆位点（MCS）：一段密集排列多个限制性内切酶识别位点的区域，方便将目的基因"剪切-连接"插入载体。
标签蛋白：His标签、GST标签（便于蛋白纯化）；Flag、HA标签（便于抗体检测）。
终止子 / PolyA信号：位于目的基因下游，标志转录终止，对真核表达而言PolyA信号还负责mRNA的稳定性。
IRES / 2A肽：用于在同一条mRNA/多肽链上实现"一个质粒表达多个蛋白"，IRES（内部核糖体进入位点）和2A自剪切肽是两种常见的多基因共表达策略。
| 颜色 | 名称 | 序列长度 | 激发光谱 | 发射光谱 | 主要用于哪些实验 |
|---|---|---|---|---|---|
| EGFP | 约720bp(239aa) | 488nm | 507nm | 蛋白定位、报告基因、活细胞成像 | |
| EYFP | 约720bp(239aa) | 514nm | 527nm | 多色标记、FRET实验 | |
| ECFP | 约720bp(239aa) | 434nm | 477nm | 多色标记、FRET实验供体荧光团 | |
| DsRed/RFP | 约680bp(225aa) | 558nm | 583nm | 与GFP区分双标记、蛋白定位 | |
| mCherry | 约711bp(236aa) | 587nm | 610nm | 光稳定性好，长时间活细胞/体内成像 | |
| mOrange | 约720bp(239aa) | 548nm | 562nm | 多色标记中间波段选择 | |
| BFP | 约720bp(239aa) | 383nm | 445nm | 多色标记（光稳定性相对较弱） | |
| Firefly Luciferase ※ | 约1653bp(550aa) | 化学发光 | 562nm(发光峰) | 报告基因活性定量，双荧光素酶主报告基因 | |
| Renilla Luciferase ※ | 约936bp(311aa) | 化学发光 | 480nm(发光峰) | 双荧光素酶实验内参，校正转染效率 |
※ 说明：Firefly/Renilla Luciferase两种荧光素酶本身不发荧光，而是通过底物氧化反应产生化学发光（无需激发光照射）； 表中色块并非"荧光颜色"，而是对应其发光光谱的近似可见色（黄绿光/蓝光，二者发光颜色本身确有差异），并加了光晕效果与真正的荧光蛋白区分开，避免混淆。
上方荧光蛋白（EGFP/EYFP等）色块对应其发射光波长的近似真实可见色。
选择提示：需要活细胞实时观察选荧光蛋白；需要更高灵敏度和更宽动态范围的定量检测，优先选荧光素酶体系；多色共定位/FRET实验需注意荧光蛋白之间的光谱重叠问题，建议提前与技术顾问确认组合方案。
| 元件类型 | 常见长度范围 | 备注 |
|---|---|---|
| 复制起点（Ori） | 约0.4–0.8 kb | pUC类高拷贝Ori通常更短 |
| 抗性基因 | 约0.8–1.5 kb | 含自身启动子 |
| 真核启动子（CMV/EF1α/CAG） | 约0.2–1.7 kb | CAG含增强子元件，相对较长 |
| 原核启动子（T7/lac） | 约20–100 bp | 通常很短 |
| 多克隆位点（MCS） | 约30–100 bp | 视酶切位点数量而定 |
| 常见荧光标签 | 约0.68–0.72 kb | 详见上方荧光标签对比表 |
| 荧光素酶 | 约0.9–1.7 kb | 比荧光蛋白更长 |
| polyA终止信号 | 约0.15–0.25 kb | |
| IRES元件 | 约0.5–0.6 kb | 比2A肽长很多 |
| 2A自剪切肽 | 约60–75 bp | 比IRES更节省空间 |
实际价值：设计"目的基因+多个元件"的载体方案时，可快速估算总长度，提前判断是否接近病毒包装（尤其是AAV约4.7kb的严格限制）的容量上限。
用于扩增、保存DNA片段，通常不含真核表达元件
真核/原核，用于让细胞实际表达目的基因
荧光素酶、GFP等，检测转录活性或验证互作
慢病毒/腺病毒/AAV转移质粒，需配合包装质粒使用
含Cas9和/或sgRNA骨架，用于基因编辑
可在原核和真核系统间穿梭复制，兼具克隆与表达功能
原核表达载体 / 哺乳动物表达载体 / 酵母表达载体 / 昆虫表达载体 / 植物表达载体
高拷贝（如pUC系列，产量高，适合常规实验）/ 低拷贝（如pBR322/p15A系列，适合毒性蛋白表达或双质粒共存）/ 单拷贝（BAC，适合大片段克隆）
质粒DNA建议-20℃保存（冻干粉或TE缓冲液溶解后），避免反复冻融导致降解；菌液/工程菌建议-80℃甘油保存，复苏时注意无菌操作。
确认感受态细胞的抗性筛选标记与质粒匹配；不同感受态细胞的转化效率差异较大，大片段质粒（>10kb）建议使用电转化法提高效率。
即使是现货质粒，收到后建议关键区域测序验证一次，尤其是插入片段与酶切位点附近，避免因运输、保存导致的意外突变影响实验结果。
含有重复序列、大片段插入或对宿主有毒性的质粒，在细菌扩增过程中存在丢失/重组风险，建议控制培养温度与传代次数。
用于哺乳动物细胞转染（尤其是原代细胞、体内实验）时，建议选择内毒素去除级别的质粒纯化方式，普通miniprep级别可能影响转染效率或细胞状态。
没有抗性标记，就无法从大量未摄入质粒的细菌/细胞中，筛选出真正成功转化的那一小部分。
常规实验优先选高拷贝（产量高、够用）；如果目的基因对宿主有毒性，或者需要两个质粒同时稳定共存，低拷贝往往是更稳妥的选择。
从外圈的限制性酶切位点，到内部标注的功能元件（启动子/基因/抗性标记的箭头方向），箭头方向代表转录方向——读懂图谱能帮你快速判断这个质粒是否适合你的克隆策略。
起始密码子ATG周围的一段保守序列，直接影响真核核糖体识别起始密码子的效率，优化Kozak序列有时能显著提升目的蛋白的表达量。
多数课题会先用质粒瞬时转染做"预实验"，验证方案可行后，再决定是否升级到病毒载体做稳定表达或体内实验——这样能用更低成本提前排除无效方案。